او پیش از حضور در سینما سال‌ها در صحنه تئاتر بازیگری آموخت و در سال 1336 در اداره تازه تاسیس هنرهای دراماتیک استخدام شد نقش کمال‌الملک را به‌خوبی بازی کرد؛ انگار خود استاد بود. عرب‌زاده شاگرد استاد نقاش هم به او گفت که نقش استادش را خوب بازی کرده؛ فقط قد جمشید مشایخی، کمی کوتاه‌تر از کمال‌الملک بود. جمشید مشایخی نقش‌های ماندگاری در سینمای ایران ایفا کرد؛ از نقشش در «قیصر» گرفته تا «یک بوس کوچولو». همین‌طور او با بهترین کارگردانان ایرانی همکاری کرد. به قول حاتمی، او بهترین کسی است که دیالوگ‌های شاعرانه‌اش را می‌گوید. دیالوگ‌هایش در «سوته‌دلان» را به یاد بیاورید یا در «هزاردستان» و حتی «کمال‌الملک» را. بعد از انقلاب، او مدتی مدیر اداره تئاتر شد تا اینکه بیماری باعث شد از نمایشی در حال تمرین بیرون برود و بعد از آن، نمایش دیگری کار نکرد تا 7سال پیش. با اینکه حکم استخدامی او در اداره تئاتر ،کارگردانی است اما او تنها یک نمایش را کارگردانی و تمام وقتش را صرف بازیگری کرد. مشایخی سه فرزند دارد؛ نادر، نغمه و سام. شاید شناخته‌شده‌ترین آنها نادر مشایخی باشد. نادر، حالا رهبر ارکستر تهران است و سال‌ها در اتریش موسیقی خواند و ارکسترهای مختلفی را رهبری کرد. شاید وجه تشابه بهترین بازیگران سینمای ایران همین باشد؛ فرزندان مشایخی و انتظامی، هر دو از بهترین آهنگسازان ایران هستند.